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| Instituto Nacional de Chile (1913) (Photo credit: Wikipedia) |
Los anticuerpos monoclonales han sido durante mucho tiempo potentes herramientas para la investigación básica, así como para el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Tradicionalmente, los investigadores obtuvieron dichos anticuerpos de roedores utilizando la técnica desarrollada por premios Nobel Georges Köhler y César Milstein a mediados de la década de 1970 (Nature, 256:495-97, 1975). En este enfoque, los investigadores primero recogen las células productoras de anticuerpos a partir de ratones expuestos a un antígeno de interés y se fusionan a células de mieloma, formando los denominados hibridomas que pueden sobrevivir durante un largo tiempo en cultivo. Mediante un cribado células híbridas únicas para las que producen el anticuerpo de interés, los investigadores pueden desarrollar una línea celular generando cantidades prácticamente ilimitadas de anticuerpos altamente específicos.
Los anticuerpos derivados de animales, sin embargo, son problemáticos para su uso como agentes terapéuticos, debido a que las moléculas pueden activar respuestas inmunes en seres humanos. Para evitar este problema, los investigadores han desarrollado varios métodos diferentes para la obtención de anticuerpos que se producen de forma natural por las células inmunes humanas en respuesta a agentes patógenos o antígenos específicos. Una estrategia implica el aislamiento de células B de memoria humanos que han sido purificadas a partir de una muestra de sangre e inmortalizando ellos mediante la infección con el virus de Epstein-Barr, a continuación, la detección cultivos in vitro para los que generan anticuerpos con la especificidad deseada. "Esto ha sido de gran valor para muchos años, y los distintos laboratorios han hecho cosas para hacer de este un proceso más eficiente", dice Patrick Wilson, profesor asociado de inmunología en la Universidad de Chicago. "Pero es laborioso en el laboratorio, ya que hay que hacer todas estas líneas celulares, y tienes que defender muchas células." Por otra parte, no todas las células sobreviven al proceso de inmortalización, lo que limita el número de anticuerpos naturales que se pueden aislar utilizando como un enfoque.
Más recientemente, Wilson y otros han ideado formas para aislar células individuales, B específicas de antígeno a partir de la sangre de donantes humanos con respuestas inmunes activas contra un patógeno o vacuna en particular. Para cada célula aislada, que por separado clonar los dos genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras que componen un anticuerpo, y que varían en secuencia de célula a célula. "Si usted no tiene tanto, usted no tiene un anticuerpo", dice Wilson. "Y no se puede mezclar sus células, porque obtendrá una cadena pesada de un celular y una cadena ligera de otra célula", y por lo tanto no puede terminar con una combinación natural de las cadenas pesadas y ligeras. Una vez que los investigadores han clonado los pares de genes-pesada y de cadena ligera que se encuentran de forma natural en las células, que pueden producir versiones recombinantes de cada anticuerpo en el laboratorio. Esta técnica, conocida comúnmente como la clonación de expresión ", es de gran alcance porque no estás de células B que se pueden aislar, en cualquier contexto alguno limitado, usted puede hacer un anticuerpo a partir de", dice Wilson. "El problema con esto es que hay un montón de pasos para cada celda para clonar los genes de anticuerpos."
Esta técnica es la mejor para "cuando se tiene una población enriquecida de antígeno-específica de células no-están allí, a excepción de un breve periodo de tiempo después de la vacunación o infección", dice Wilson. Sería extremadamente laborioso de usar esta estrategia para tratar de identificar un anticuerpo contra un antígeno de interés usando la sangre de una persona sin una respuesta inmune activa, dice, porque millones de células B de memoria están presentes en la sangre, cada uno de los cuales es únicamente específico para un antígeno diferente.
Aunque todos estos enfoques han sido valioso para la identificación de nuevos anticuerpos y la caracterización de las respuestas inmunes humanas, que son mucho tiempo y es complicada. Aquí, el científico habló con algunos expertos que están trabajando en nuevas formas de acelerar el descubrimiento y aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Método cultura basada en la célula
Trazando el camino: las células B crecen en cultivo en pocillos individuales sobre una capa de células de alimentación, y los medios de cultivo de células se analiza para detectar la especificidad de unión de anticuerpos o actividad neutralizante. El uso de la PCR, los investigadores luego amplifican los genes de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de interés, clonar en vectores de expresión, y la secuencia de ellos. Los vectores de expresión se transfectan en células, y los anticuerpos resultantes se purifican y se prueban para la actividad.
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EL PERSONAL CIENTÍFICO
Usuario: Mark Connors, jefa de la Sección de VIH específica Inmunidad, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland
Proyecto: Aislar nuevos anticuerpos ampliamente neutralizantes potentes contra el VIH
Problema: La inmortalización de células productoras de anticuerpos de los pacientes infectados con VIH puede ser ineficiente, e incluso cuando las células se inmortalizan con éxito, algunos clones tienden a ser inestables. Mientras que los investigadores anteriores han obtenido anticuerpos neutralizantes del VIH-el uso de sondas fluorescentes para sacar antígenos específicos de células B de memoria de una muestra de sangre, Connors y su equipo querían descubrir nuevos anticuerpos neutralizantes del VIH, sin limitarse sólo a aquellos que son específicos para antígenos conocidos.
Solución: Connors y su equipo primero utilizaron citometría de flujo para aislar las células B de un donante infectado por el VIH. Pero en lugar de la clonación de los anticuerpos genes pesados y-cadena ligera de cada célula, como en una típica expresión de clonación de la configuración, el grupo de Connors distribuye las células aisladas en placas de 384 pocillos, donde las cultivaron en presencia de células alimentadoras y moléculas de señalización que ayudan a mantener vivas las células B y también estimulan a secretar anticuerpos. Después de dos semanas, los investigadores analizaron el sobrenadante de cada pocillo para su capacidad de neutralizar el VIH in vitro. Luego se clonaron los genes de anticuerpos de las células que producían sobrenadantes con actividad neutralizante y, finalmente, producen versiones recombinantes de los anticuerpos (Nat. Protoc, 8:1907-15, 2013). Usando este método, Connors y su equipo aislaron dos nuevos anticuerpos que neutralizan potentemente muchas cepas diferentes de VIH (Nature, 491:406-12, 2012).
Pros:
No requiere que los usuarios conocer la especificidad de unión de los anticuerpos que van después de
Aplicable a las porciones de diversas enfermedades. "Siempre y cuando usted tiene una función objetivo que se puede utilizar para la detección, que le permite sacar los anticuerpos", dice Connors.
El protocolo completo dura alrededor de tres semanas en completarse, dice Connors.
Las células de alimentación están disponibles gratuitamente a través del programa de reactivo SIDA.
Contras:
Los reactivos requeridos para ensayos de neutralización pueden ser costosos.
Aunque esta estrategia teóricamente se puede hacer a mano, el gran número de pozos que se deben defender-en el caso de Connors, tantos como 60,000-140,000-hace que esta técnica más susceptibles de laboratorios con equipos de manejo de líquidos robóticos.
Algunas células productoras de anticuerpos pueden no sobrevivir al proceso de cultivo.
Costo: Connors estima que su técnica cuesta aproximadamente $ 400 - $ 500 por placa de 384 pocillos. Dependiendo del rendimiento de las células B de una muestra de sangre, los investigadores probablemente utilizar cerca de 20 placas para un manual de puesta a punto, y 60 a 80 placas por un robot de configuración.
De alto rendimiento de secuenciación de ADN
RÁPIDO Y ESPECÍFICO: Identificar anticuerpos mediante secuenciación de ADN, las células B individuales se aislaron por primera vez en micropocillos y lisadas en presencia de microperlas magnéticas que capturan los ARNm-región variable de cadena pesada y ligera (VH y VL). Los ARNm son amplificadas por PCR usando cebadores que combinan las transcripciones VH y VL en un único amplicón de ADNc. Estos amplicones se secuenciaron a continuación, y métodos bioinformáticos se utilizan para identificar VH: pares VL. Estos genes VH y VL se clonan a continuación y se expresan en las células, seguido de la purificación del anticuerpo resultante.
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B. DeKosky Y G. GEORGIOU (imagen de la inserción); EL PERSONAL CIENTÍFICO
Usuario: George Georgiou, profesor de ingeniería química e ingeniería biomédica de la Universidad de Texas en Austin
Proyecto: Utilice secuenciación de alto rendimiento para descubrir, anticuerpos humanos nativos de antígenos específicos
Problema: En un artículo publicado en 2010, el grupo de Georgiou mostró que se podía utilizar la secuenciación de alto rendimiento de los genes de inmunoglobulina para producir rápidamente anticuerpos específicos de antígeno (Nat. Biotechnol, 28:965-69, 2010). El equipo simplemente generado anticuerpos recombinantes utilizando los genes pesados y de cadena ligera que se expresaron de forma más abundante en las células productoras de anticuerpos de los ratones después de la inmunización. Sin embargo, la técnica no podía distinguir qué pares de los genes-pesadas y cadenas ligeras se expresaron originalmente por cada una de las células productoras de anticuerpos del animal. Por lo tanto, para reconstruir un anticuerpo nativo, Georgiou necesita una estrategia para secuenciar las cadenas pesadas y ligeras juntos.
Solución: el equipo de Georgiou utiliza primero citometría de flujo para purificar las células B de la sangre. Luego, los investigadores aislaron células individuales en los pozos 125 picolitros de una diapositiva, y se amplificaron porciones de las regiones variables de ambos los genes pesados-y-cadena ligera de cada célula, utilizando cebadores de PCR especializados que incorporan ambos fragmentos de genes en una sola pieza de ADN. Entonces utilizaron secuenciación de próxima generación para descifrar las secuencias de las hebras y enlaces de procesamiento de la bioinformática para analizar los pares de cadenas pesadas y ligeras. Usando este enfoque, se identificaron 86 pares únicos de cadenas pesadas y ligeras de las células productoras de anticuerpos de un donante humano que habían sido inmunizados con toxoide tetánico (Nat Biotechnol, 31:166-69, 2013). Cuando se producen 10 diferentes anticuerpos recombinantes utilizando las secuencias de 10 de los pares, encontraron que la totalidad de sus anticuerpos unidos toxoide del tétanos in vitro con alta afinidad. Por el contrario, los estudios anteriores han demostrado que sólo el 10 por ciento de los anticuerpos generados usando técnicas que se basan en el apareamiento aleatorio de los genes-pesadas y cadenas ligeras son antígeno-específica, dice Brandon DeKosky, un estudiante graduado en el laboratorio de Georgiou que ayudó para desarrollar la técnica.
Pros:
Muy rápido. "Usted puede ir de las células a las secuencias de cadena pesada y ligera humanos totalmente nativas dentro de una semana", dice DeKosky.
? Identifica las secuencias nativas de anticuerpos
Puede identificar inmunoglobulinas codificadas por clones de células B raras
También útil para el seguimiento del desarrollo de las células B durante la respuesta inmune
Contras:
Las diapositivas de micropocillos no están disponibles comercialmente, por lo que los usuarios tendrán que hacer su propio.
Los usuarios necesitarán un poco de experiencia en bioinformática para analizar las secuencias
Costo: DeKosky dice que su equipo gastó unos 550 dólares de los reactivos necesarios para obtener las secuencias de más de 2700 pares únicos de genes de anticuerpos de una muestra de células B.
Proteómica Minería
INTERROGATORIO INTEGRAL: Identificar anticuerpos por la minería proteómica, anticuerpos específicos de antígeno se purifica primero a partir de suero. Las proteasas digieren los anticuerpos en péptidos que son analizados por espectrometría de masas. Para identificar estos péptidos, una base de datos de referencia se genera mediante la secuenciación de los genes VH y VL a partir de células B aisladas de la misma muestra de sangre. Las combinaciones de secuencias VH y VL se clonan a continuación y se expresan en células para generar anticuerpos que se investigan luego respecto a su especificidad y actividad de unión.
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EL PERSONAL CIENTÍFICO
Usuario: Roberto Polakiewicz, director científico, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts
Proyecto: Identificar anticuerpos que están realmente presentes en el suero de los seres humanos y animales para producir versiones recombinantes de alta afinidad
Problema: Los anticuerpos generados por las estrategias de-sea a través de la inmortalización de las células B, la clonación de expresión, o basado en células no secuenciación-son representativas de las repertorio completo de anticuerpos que son realmente circulando en el suero in vivo. Eso es debido a que algunas células pueden morir durante el proceso de aislamiento, y los anticuerpos codificados por otros no pueden en realidad ser secretada a la circulación. "La razón por la que hacemos anticuerpos es combatir las infecciones", dice Polakiewicz, y por lo tanto, "lo que importa es lo que circula, porque esos son los anticuerpos que terminan encontrando los agentes patógenos y recordando otras células inmunitarias para deshacerse de ellos." Por tanto, , Polakiewicz y sus colegas querían desarrollar una estrategia para analizar directamente los anticuerpos que circulan en la sangre.
Solución: El equipo de Polakiewicz volvió a la proteómica. Se utilizó por primera vez la purificación por afinidad de aumentar las fracciones de anticuerpos específicos aislados a partir del suero de un donante que recientemente habían sido vacunados contra el virus de la hepatitis B. (Para más información sobre las estrategias para la purificación de anticuerpos, consulte "Pursuits puro" The Scientist, Mayo 2012). El equipo luego digiere estos anticuerpos con proteasas para generar fragmentos de péptidos y los analizó usando espectrometría de masas. Para interpretar los espectros de masas, los investigadores tuvieron que construir una base de datos de referencia a medida por la secuenciación de los genes de anticuerpos de las células del donante B. "No se puede utilizar todo el genoma", dice Polakiewicz. "Eso le dará secuencias de células B de la línea germinal, pero no las secuencias que fueron creadas de novo tras la inmunización."
Mediante la comparación de las secuencias de genes de inmunoglobulina con los espectros de masas de péptidos, el equipo de Polakiewicz fue capaz de identificar y clonar los genes pesados y de cadena ligera que codifican los anticuerpos presentes en la muestra de suero y generar varios anticuerpos recombinantes que se unían con alta afinidad a la de la hepatitis antígeno del virus B (Nat. Biotechnol, 30:1039-43, 2012).
Pros:
Permite a los investigadores a analizar la composición de los anticuerpos presentes en la circulación humana
Podría ser utilizado para rastrear cambios en el repertorio de anticuerpos circulantes-a través del tiempo
Contras:
El software del equipo utilizado en el análisis bioinformático de las secuencias de péptidos y genes se desarrolló en la casa, por lo que los usuarios tendrán que crear su propia cuenta.
? Este enfoque altera el emparejamiento nativo de las cadenas pesadas y ligeras presentes en los anticuerpos en el suero.
? Se requiere una experiencia sustancial en la secuenciación y espectrometría de masas
? Trabajo intensivo. Toma alrededor de 21 días para generar anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales.
Costo: Polakiewicz no pudo estimar el costo de la identificación de anticuerpos usando un enfoque basado en la proteómica, pero dice que probablemente cuesta lo mismo o un poco menos que una de las estrategias basadas en las células utilizadas.
